周游记

发酵生产过程大多为纯种培养过程，需要在无杂菌污染的条件下进行。发酵生产的环节比较多，尤其是好氧发酵生产，既要连续搅拌和供给无菌空气，又要排放多余空气、多次添加消泡剂、补充培养基、定时取样分析及不断改变空气量供给等，这些操作都给防治发酵生产染菌带来了很大的困难。所谓发酵染菌是指在发酵过程中，生产菌以外的其他微生物侵入了发酵系统，从而使发酵过程失去真正意义上的纯种培养这一现象。为了防止染菌，人们采取了一系列措施，如改进生产工艺，对发酵罐、管道和其他附属设备、培养基及空气等严格灭菌。对水、无菌空气除严格按无菌要求供应外，还健全了生产技术管理制度，大大降低了生产过程染菌率。但是至今仍无法完全避免染菌的严重威胁，轻者影响了产品的收率和产品质量，重者会导致“倒罐”，造成严重的经济损失。据报道，国外抗生素发酵染菌率为2％～5％，国内的青霉素发酵染菌率2％，链霉素、红霉素和四环素发酵染菌率5％，谷氨酸发酵噬菌体感染率1％～2％。染菌对发酵生产率、提取率、得率、产品质量和三废治理等都有很大的影响。
从国内外目前的报道来看，在现有的科学技术条件下要做到完全不染菌是不可能的。目前要做的是要提高生产技术水平，强化生产过程管理，防止发酵染菌的发生。一旦发生染菌，应尽快找出污染的原因，并采取相应的有效措施，把发酵染菌造成的损失降低到最小。[separator]
第一节 染菌对发酵的影响
染菌对发酵过程的影响是很大的，但由于生产的产品不同、污染杂菌的种类和性质不同、染菌发生的时间不同以及染菌的途径和程度不同，染菌造成的危害及后果也不同。
一、染菌对不同发酵过程的影响
由于各种发酵过程所用的微生物菌种、培养基以及发酵的条件、产物的性质不同，染菌造成的危害程度也不同。如青霉素的发酵过程，由于许多杂菌都能产生青霉素酶，因此不管染菌是发生在发酵前期、中期或后期，都会使青霉素迅速分解破坏，使目的产物得率降低，危害十分严重。对于核苷或核苷酸的发酵过程，由于所用的生产菌种是多种营养缺陷型微生物，其生长能力差，所需的培养基营养丰富，因此容易受到杂菌的污染，且染菌后，培养基中的营养成分迅速被消耗，严重抑制了生产菌的生长和代谢产物的生成。对于柠檬酸等有机酸的发酵过程，一般在产酸后，发酵液的pH值比较低，杂菌生长十分困难，在发酵中、后期不太会发生染菌，主要是要预防发酵前期染菌。但是，不管是对于哪种发酵过程，一旦发生染菌，都会由于培养基中的营养成分被消耗或代谢产物被分解，严重影响到产物的生成，使发酵产物的产量大为降低。谷氨酸发酵周期短，生产菌繁殖快，培养基不太丰富，一般较少污染杂菌，但噬菌体污染对谷氨酸发酵的威胁非常大。
二、染菌发生的不同时间对发酵的影响
从发生染菌的时间来看，染菌可分为种子培养期染菌、发酵前期染菌、发酵中期染菌和发酵后期染菌等四个不同的染菌时期，不同的染菌时期对发酵所产生的影响也是有区别的。
⑴ 种子培养期染菌 种子培养主要是使生产菌生长与繁殖，此时，微生物菌体浓度低，培养基的营养十分丰富，比较容易染菌。若将污染的种子带入发酵罐，则危害极大，因此应严格控制种子染菌的发生。一旦发现种子受到杂菌的污染，应经灭菌后弃去，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。
⑵ 发酵前期染菌 在发酵前期，微生物菌体主要是处于生长、繁殖阶段，此时期代谢的产物很少，相对而言这个时期也容易染菌，染菌后的杂菌将迅速繁殖，与生产菌争夺培养基中的营养物质，严重干扰生产菌的正常生长、繁殖及产物的生成。
⑶ 发酵中期染菌 发酵中期染菌将会导致培养基中的营养物质大量消耗，并严重干扰生产菌的代谢，影响产物的生成。有的染菌后杂菌大量繁殖，产生酸性物质，使 pH值下降，糖、氮等的消耗加速，菌体发生自溶，致使发酵液发黏，产生大量的泡沫，代谢产物的积累减少或停止；有的染菌后会使已生成的产物被利用或破坏。从目前的情况来看，发酵中期染菌一般较难挽救，危害性较大，在生产过程中应尽力做到早发现，快处理。
⑷ 发酵后期染菌 由于在发酵后期，培养基中的糖等营养物质已接近耗尽，且发酵的产物也已积累较多，如果染菌量不太多，对发酵影响相对来说就要小一些，可继续进行发酵。对发酵产物来说，发酵后期染菌对不同的产物的影响也是不同的，如柠檬酸的发酵，染菌对产物的影响不大；抗生素、肌苷酸、谷氨酸、氨基酸等的发酵，后期染菌也会影响产物的产量、提取和产品的质量。
三、染菌程度对发酵的影响
染菌的程度对发酵的影响是很大的。染菌程度愈严重，即进入发酵罐内的杂菌数量愈多，对发酵的危害也就愈大。当生产菌在发酵过程已有大量的繁殖，并已在发酵液中占优势，污染极少量的杂菌，对发酵不会带来太大的影响，因为进入发酵液的杂菌需要有一定的时间才能达到危害发酵的程度，而且此时环境对杂菌繁殖已相当不利。当然如果染菌程度严重时，尤其是在发酵的前期或发酵的中期，对发酵将会产生严重的影响。
第二节 发酵异常现象及原因分析
一、种子培养和发酵的异常现象
发酵过程中的种子培养和发酵的异常现象是指发酵过程中的某些物理参数、化学参数或生物参数发生与原有规律不同的改变，这些改变必然影响发酵水平，使生产蒙受损失。对此，应及时查明原因，加以解决。
⒈ 种子培养异常
种子培养异常表现在培养的种子质量不合格。种子质量差会给发酵带来较大的影响。然而种子内在质量常被忽视，由于种子培养的周期短，可供分析的数据较少，因此种子异常的原因一般较难确定，也使得由种子质量引起的发酵异常原因不易查清。种子培养异常的表现主要有菌体生长缓慢、菌丝结团、菌体老化以及培养液的理化参数变化。
⑴ 菌体生长缓慢 种子培养过程中菌体数量增长缓慢的原因很多。培养基原料质量下降、菌体老化、灭菌操作失误、供氧不足、培养温度偏高或偏低、酸碱度调节不当等都会引起菌体生长缓慢。此外，接种物冷藏时间长或接种量过低而导致菌体量少，或接种物本身质量差等也都会使菌体数量增长缓慢。
⑵ 菌丝结团 在培养过程中有些丝状菌容易产生菌丝团，菌体仅在表面生长，菌丝向四周伸展，而菌丝团的中央结实，使内部菌丝的营养吸收和呼吸受到很大影响，从而不能正常地生长。菌丝结团的原因很多，诸如通气不良或停止搅拌导致溶氧浓度不足；原料质量差或灭菌效果差导致培养基质量下降；接种的孢子或菌丝保藏时间长而菌落数少，培养液泡沫多；罐内装料小、菌丝粘壁等会导致培养液的菌丝浓度比较低；此外，接种物种龄短等也会导致菌体生长缓慢，造成菌丝结团。
⑶ 代谢不正常 代谢不正常表现出糖、氨基氮浓度等变化不正常，菌体浓度和代谢产物浓度不正常。造成代谢不正常的原因很复杂，除与接种物质量和培养基质量差有关外，还与培养环境条件差、接种量小、杂菌污染等有关。
⒉ 发酵异常
不同种类的发酵过程所发生的发酵异常现象，形式虽然不尽相同，但均表现出菌体生长速度缓慢、菌体代谢异常或过早老化、耗糖慢、pH值的异常变化、发酵过程中泡沫的异常增多、发酵液颜色的异常变化、代谢产物含量的异常下跌、发酵周期的异常拖长、发酵液的黏度异常增加等。
⑴ 菌体生长差 由于种子质量差或种子低温放置时间长导致菌体数量较少、停滞期延长、发酵液内菌体数量增长缓慢、外形不整齐。种子质量不好、菌种的发酵性能差、环境条件差、培养基质量不好、接种量太少等均会引起糖、氮的消耗少或间歇停滞，出现糖、氮代谢缓慢现象。
⑵ pH值过高或过低 发酵过程中由于培养基原料质量差、灭菌效果差，加糖、加油（消泡剂）过多或过于集中，将会引起pH值的异常变化。而pH值变化是所有代谢反应的综合反映，在发酵的各个时期都有一定规律，pH值的异常变化就意味着发酵的异常。
⑶ 溶氧水平异常 根据发酵过程出现的异常现象如溶氧、pH值、排气中的CO2含量以及微生物菌体酶活力等的异常变化来检查发酵是否染菌。对于特定的发酵过程 要求一定的溶氧水平，而且在不同的发酵阶段其溶氧的水平也是不同的。如果发酵过程中的溶氧水平发生了异常的变化(参看图7-5)，一般就是发酵染菌的表现。
在正常的发酵过程中，发酵初期菌体处于停滞期，耗氧量很少，溶氧基本不变；当菌体进入对数期，耗氧量增加，溶氧浓度很快下降，并且维持在一定的水平，在这阶段中操作条件的变化会使溶氧有所波动，但变化不大；而到了发酵后期，菌体衰老，耗氧量减少，溶氧又再度上升；当感染噬菌体后，生产菌的呼吸作用受抑制，溶氧浓度很快上升。发酵过程感染噬菌体后，溶氧的变化比菌体浓度更灵敏，能更好地预见染菌的发生。
由于污染的杂菌好氧性不同，产生溶氧异常的现象也是不同的。当杂菌是好氧性微生物时，溶氧的变化是在较短时间内下降，直到接近于零，且在长时间内不能回升；当杂菌是非好氧性微生物，而生产菌由于受污染而抑制生长，使耗氧量减少，溶氧升高。对于特定的发酵过程，工艺确定后，排出的气体中CO2含量的变化是规律的。染菌后，培养基中糖的消耗发生变化，引起排气中CO2含量的异常变化，如杂菌污染时，糖耗加快，CO2含量增加，噬菌体污染后，糖耗减慢， CO2含量减少。因此，可根据CO2含量的异常变化来判断是否染菌。
⑷ 泡沫过多 一般在发酵过程中泡沫的消长是有一定的规律的。但是，由于菌体生长差、代谢速度慢、接种物嫩或种子未及时移种而过老、蛋白质类胶体物质多等都会使发酵液在不断通气、搅拌下产生大量的泡沫。除此之外，培养基灭菌时温度过高或时间过长，葡萄糖受到破坏后产生的氨基糖会抑制菌体的生长，也会使泡沫大量产生，从而使发酵过程的泡沫发生异常。
⑸ 当导致营养条件较差，种子质量差，菌体或菌丝自溶等均会严重影响到培养物的生长，导致发酵液中菌体浓度偏离原有规律，出现异常现象。
二、染菌的检查和判断
发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果为依据进行判断。在发酵过程中，如何及早发现杂菌的污染并及时采取措施加以处理，是避免染菌造成严重经济损失的重要手段。因此，生产上要求能准确、迅速的检查出杂菌的污染。目前常用于检查是否染菌的无菌试验方法主要有显微镜检查法、肉汤培养法、平板(双碟)培养法、发酵过程的异常观察法等。
⒈ 显微镜检查法(镜检法)
用革兰氏染色法(Grams stain)对样品进行涂片、染色，然后在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌与杂菌的特征进行区别、判断是否染菌。如发现有与生产菌形态特征不一样的其他微生物的存在，就可判断为发生了染菌。此法检查杂菌最简单、最直接，也是最常用的检查方法之一。必要时还可进行芽孢染色或鞭毛染色。
⒉ 肉汤培养法
通常用组成为0.3％牛肉膏、0.5％葡萄糖、0.5％氯化钠、0.8％蛋白胨、0.4％的酚红溶液(pH7.2，呈红色)的酚红肉汤作为培养基，将待检样品直接接入经完全灭菌后的该肉汤培养基中，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，每6 h观察一次微生物的生长情况，并取样进行镜检，该肉汤培养基由红色变为黄色或产生浑浊，即判断为染菌。肉汤培养法常用于检查培养基和无菌空气是否带菌，也可用于噬菌体的检查。
⒊ 平板划线培养或斜面培养检查法
将待检样品在无菌平板或斜面上划线，分别于37 ℃、27 ℃进行培养，一般24 h后即可进行镜检观察，检查是否有杂菌。有时为了提高平板培养法的灵敏度，也可以将需要检查的样品先置于37 ℃条件下培养6 h，使杂菌迅速增殖后再划线培养。
无菌试验时，如果酚红肉汤连续三次发生变色反应(由红色变为黄色)或产生混浊，或平板（或斜面）培养连续三次发现有异常菌落的出现，即可判断为染菌。有时酚红肉汤培养的阳性反应不够明显，而发酵样品的各项参数确有可疑染菌，并经镜检等其他方法确认连续三次样品有相同类型的异常菌存在，也应该判断为染菌。一般来讲，无菌试验的酚红肉汤或培养平板（或斜面）应保存并观察至本批(罐)放罐后12 h，确认为无杂菌后才能弃去。

三、发酵染菌原因分析
发酵染菌后，一定要找出染菌的原因，以总结防治发酵染菌的经验教训，积极采取必要措施，把杂菌消灭在发生之前。如果对已发生的染菌不作具体分析，不了解染菌原因，未采取相应的措施来防止染菌，将会对生产造成严重的后果。造成发酵染菌的原因有很多，且常因工厂不同而有所不同，但设备渗漏、空气净化达不到要求、种子带菌、培养基灭菌不彻底和技术管理不善等是造成各厂污染杂菌的普遍原因。表8-1是日本工业技术院发酵研究所1965年对抗生素发酵染菌原因分析，表8-2为某厂链霉素发酵染菌分析，表8-3是上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析。
表8-1 日本工业技术院发酵研究所1965年对抗生素的发酵染菌原因分析

表8-2 某厂链霉素发酵染菌原因分析

表8-3 上海天厨味精厂谷氨酸发酵染菌分析

由上述表中可以看出，由于不同厂家的设备渗漏几率、技术管理好坏不同，而使各种染菌原因的百分率有所不同，其中尤以设备渗漏和空气带菌造成染菌较为普遍且严重。值得注意的是，不明原因的染菌，分别达24.91％、35.00％和35.13％。这表明，目前分析染菌原因的水平还有待于进一步提高。
㈠ 染菌的杂菌种类分析
对于每一个发酵过程而言，污染的杂菌种类的影响是不同的。如在抗生素的发酵过程中，青霉素的发酵污染细短产气杆菌比粗大杆菌的危害更大；链霉素的发酵污染细短杆菌、假单胞杆菌和产气杆菌比污染粗大杆菌更有危害；四环素的发酵过程最怕污染双球菌、芽孢杆菌和夹膜杆菌；柠檬酸的发酵最怕青霉菌的污染；谷氨酸发酵最怕噬菌体污染。因噬菌体蔓延迅速，难以防治，容易造成连续污染。若污染的杂菌是耐热的芽孢杆菌，可能是由于培养基或设备灭菌不彻底、设备存在死角等引起；若污染的是球菌、无芽孢杆菌等不耐热杂菌，可能是由于种子带菌、空气过滤效率低、除菌不彻底、设备渗漏和操作问题等引起；若污染的是真菌，就可能是由于设备或冷却盘管的渗漏（一般是浅绿色菌落）、无菌室灭菌不彻底或无菌操作不当（一般是霉菌）、糖液灭菌不彻底(特别是糖液放置时间较长)而引起。
㈡ 发酵染菌的规模分析
从染菌的规模来看，主要有三种。
① 大批量发酵罐染菌 如发生在发酵前期，可是种子带菌或连消设备引起染菌；如果染菌发生在发酵中期、后期，且这些杂菌类型相同，则一般是空气净化系统存在诸如空气系统结构不合理、空气过滤器介质失效等问题；如果空气带菌量不多，无菌试验的显现时间较长，这就使分析防治空气带菌增加了难度。
② 部分发酵罐染菌 如果染菌发生在发酵前期，就可能是种子染菌、连消系统灭菌不彻底；如果是发酵后期染菌，则可能是中间补料染菌，如补料液带菌、补料管渗漏。
③ 个别发酵罐连续染菌(此时如果采用间歇灭菌工艺，一般不会发生连续染菌) 个别发酵罐连续染菌，大都是由于设备渗漏造成，应仔细检查阀门、罐体或罐器是否清洁等。一般设备渗漏引起的染菌，会出现每批染菌时间向前推移的现象。
㈢ 不同污染时间分析
从发生染菌的时间来分析，也是三种情况。
① 染菌发生在种子培养阶段，或称种子培养基染菌。此时通常是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素等原因而引起染菌。
② 在发酵过程的初始阶段发生染菌，或称发酵前期染菌。此时大部分染菌也是由种子带菌、培养基或设备灭菌不彻底，以及接种操作不当或设备因素、无菌空气带菌等原因而引起。
③ 发酵后期染菌大部分是由空气过滤不彻底、中间补料染菌、设备渗漏、泡沫顶盖以及操作问题而引起染菌。
第三节 杂菌污染的途径和防治
一、种子带菌及其防治
由于种子带菌而发生的染菌率虽然不高，但它是发酵前期染菌的重要原因之一，是发酵生产成败的关键，因而对种子染菌的检查和染菌的防治是极为重要的。种子带菌的原因主要有保藏的斜面试管菌种染菌、培养基和器具灭菌不彻底、种子转移和接种过程染菌以及种子培养所涉及的设备和装置染菌等。针对上述染菌原因，生产上常用以下的一些措施予以防治。
① 严格控制无菌室的污染，根据生产工艺的要求和特点，建立相应的无菌室，交替使用各种灭菌手段对无菌室进行处理。除常用的紫外线杀菌外，如发现无菌室已污染较多的细菌，可采用石碳酸或土霉素等进行灭菌；如发现无菌室有较多的霉菌，则可采用制霉菌素等进行灭菌；如果污染噬菌体，通常就用甲醛、双氧水或高锰酸钾等灭菌剂进行处理。
② 在制备种子时对沙土管、斜面、三角瓶及摇瓶均严格进行管理，防止杂菌的进入而受到污染。为了防止染菌，种子保存管的棉花塞应有一定的紧密度，且有一定的长度，保藏温度尽量保持相对稳定，不宜有太大变化。
③ 对每一级种子的培养物均应进行严格的无菌检查，确保任何一级种子均未受杂菌感染后才能使用。
④ 对菌种培养基或器具进行严格的灭菌处理，保证在利用灭菌锅进行灭菌前，先完全排除锅内的空气，以免造成假压，使灭菌的温度达不到预定值，造成灭菌不彻底而使种子染菌。
二、空气带菌及其防治
无菌空气带菌是发酵染菌的主要原因之一。要杜绝无菌空气带菌，就必须从空气的净化工艺和设备的设计、过滤介质的选用和装填、过滤介质的灭菌和管理等方面完善空气净化系统。
加强生产环境的卫生管理，减少生产环境中空气的含菌量，正确选择采气口，如提高采气口的位置或前置粗过滤器，加强空气压缩前的预处理，如提高空压机进口空气的洁净度。
设计合理的空气预处理工艺，尽可能减少生产环境中空气带油、水量，提高进入过滤器的空气温度，降低空气的相对湿度，保持过滤介质的干燥状态，防止空气冷却器漏水，防止冷却水进入空气系统等。
设计和安装合理的空气过滤器，防止过滤器失效。选用除菌效率高的过滤介质，在过滤器灭菌时要防止过滤介质被冲翻而造成短路，避免过滤介质烤焦或着火，防止过滤介质的装填不均而使空气走短路，保证一定的介质充填密度。当突然停止进空气时，要防止发酵液倒流入空气过滤器，在操作过程中要防止空气压力的剧变和流速的急增。
三、操作失误导致染菌及其防治
一般来说，稀薄的培养基比较容易灭菌彻底，而淀粉质原料，在升温过快或混合不均匀时容易结块，使团块中心部位“夹生”，蒸汽不易进入将杂菌杀死，但在发酵过程中这些团块会散开，而造成染菌。同样由于培养基中诸如麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多，在投料时溅到罐壁或罐内的各种支架上，容易形成堆积，这些堆积物在灭菌过程中由于传热较慢，一些杂菌也不易被杀灭，一旦灭菌操作完成后，通过冷却、搅拌、接种等操作，含有杂菌的堆积物将重新返回培养液中，造成染菌。通常对于淀粉质培养基的灭菌采用实罐灭菌较好，一般在升温前先通过搅拌混合均匀，并加入一定量的α-淀粉酶进行液化；有大颗粒存在时应先经过筛除去，再行灭菌；对于麸皮、黄豆饼一类的固形物含量较多的培养基，采用罐外预先配料混均，再转至发酵罐内进行实罐灭菌较为有效。
灭菌时由于操作不合理，未将罐内的空气完全排除，造成压力表显示“假压”，使罐内温度与压力表指示的不对应，培养基的温度以及罐顶局部空间的温度达不到灭菌的要求，导致灭菌不彻底而染菌。因此，在灭菌升温时，应打开排气阀门及有关联接管的边阀、压力表接管边阀等，使蒸汽通过排空，达到彻底灭菌。
培养基在灭菌过程中很容易产生泡沫，发泡严重时泡沫可上升至罐顶甚至逃逸，造成泡沫顶罐，杂菌很容易藏在泡沫中，由于泡沫的薄膜及泡沫内的空气传热差，使泡沫内的温度低于灭菌温度，一旦灭菌操作完毕并进行冷却时，这些泡沫就会破裂，杂菌就会释放到培养基中，造成染菌。因此，要严防泡沫升顶，尽可能添加消泡剂防止泡沫的大量产生。
在连续灭菌过程中，培养基灭菌的温度及其停留时间必须符合灭菌的要求，尤其是在灭菌结束前的最后一部分培养基也要善始善终，以确保彻底灭菌。避免蒸汽压力的波动过大，应严格控制灭菌的温度，过程最好采用自动控温。
发酵过程中越来越多地采用了自动控制，一些控制仪器逐渐被应用。如用于连续测定并控制发酵液pH值的复合玻璃电极、测定溶氧浓度的探头等，这些探头或元件如用蒸汽进行灭菌，不但容易损坏，还会因反复经受高温而大大缩短其使用寿命。因此，一般常采用化学试剂浸泡等方法来灭菌。但常会因灭菌不彻底，放入发酵罐后导致染菌。
在发酵过程中，如工人操作不当也会引起染菌，如移种时或发酵过程罐内压力跌零，使外界空气进入而染菌；未及时添加消泡剂导致泡沫顶盖而染菌；压缩空气压力突然下降，使发酵液倒流入空气过滤器而造成污染；等等。防止操作失误引起染菌，要加强对工人的技术培训和责任心教育，提高工人素质，强化措施和管理。
四、设备渗漏或“死角”造成的染菌及其防治
设备渗漏主要是指发酵罐、补糖罐、冷却盘管、管道阀门等，由于化学腐蚀(发酵代谢所产生的有机酸等发生腐蚀作用)、电化学腐蚀(如氧溶解于水，使金属不断失去电子，加快腐蚀作用)、磨蚀(如金属与原料中的泥沙之间磨损)、加工制作不良等原因形成微小漏孔后发生渗漏染菌。
发酵设备、管道、阀门的长期使用，由于腐蚀、磨擦和振动等原因，往往造成渗漏。例如：发酵设备的表面或焊缝处如有砂眼，由于腐蚀逐渐加深，最终导致穿孔。盘管是发酵过程中用于通冷却水进行冷却或蒸汽进行加热的蛇形金属管，是最易发生渗漏的部件之一。盘管受搅拌器作用，长期磨损，焊缝处受冷热和振动产生裂缝，或发酵液的pH值低、化学腐蚀严重等原因造成渗漏。为了避免发酵设备、管道、阀门渗漏，应选用优质的材料，经常进行检查并及时处理渗漏隐患。盘管的微小渗漏不易被发现，可以压入碱性水；在罐内可疑地方，用浸湿酚酞指示剂的白布擦，如有渗漏时白布显红色。管件的渗漏主要是指阀门的渗漏，目前生产上使用的阀门不能完全满足发酵工程的工艺要求，是造成发酵染菌的主要原因之一。采用加工精度高、材料好的阀门可减少此类染菌的发生。
由于操作、设备结构、安装及其他人为因素造成的屏障等原因，使蒸汽不能有效到达预定的灭菌部位，而不能达到彻底灭菌的目的。生产上常把这些不能彻底灭菌的部位称为“死角”。
空气分布管一般安装于靠近搅拌桨叶的部位，受搅拌与通气的影响很大，易磨蚀穿孔造成“死角”，产生染菌。尤其是采用环形空气分布管时，由于管中的空气流速不一致，靠近空气进口处流速最大，离进口处距离越远流速越小，因此，远离进口处的管道常被来自空气过滤器中的活性炭或培养基中的某些物质所堵塞，最易产生“死角”而染菌。通常采取频繁更换空气分布管或认真洗涤等措施。
罐内的部件如挡板、扶梯、搅拌轴、拉杆、联轴器、冷却管等及其支撑件、温度计套管焊接处等的周围容易积集污垢，形成“死角”而染菌。采取罐内壁涂刷防腐涂料、加强清洗并定期铲除污垢等是有效消除染菌的措施。发酵罐的制作不良，如不锈钢衬里焊接质量不好，使不锈钢与碳钢之间不能紧贴，导致不锈钢与碳钢之间有空气存在，在灭菌加温时，由于不锈钢、碳钢和空气这三者的膨胀系数不同，不锈钢会鼓起，严重者还会破裂，从而造成“死角”染菌（见图8-1）。全部采用不锈钢或复合钢制作发酵罐可有效克服此弊端。同时发酵罐封头上的人孔、排气管接口、照明灯口、视镜口、进料管口、压力表接口等也是造成“死角”的潜在因素，一般通过安装边阀，使灭菌彻底，并注意清洗是可以避免染菌的。除此之外，发酵罐底常有培养基中的固形物堆积，形成硬块，这些硬块有一定的绝热性，使藏在里面的脏物、杂菌不能在灭菌时候被杀死而染菌（见图8-2）。通过加强罐体清洗、适当降低搅拌桨位置都可减少罐底积垢，减少染菌。罐底的加强板长期受压缩空气顶吹而腐蚀、受损或裂缝，或焊接不当，造成灭菌不彻底（见图8-3）。应煅成与罐底相同弧度，使之吻合紧密，并注意焊接质量。发酵罐的修补焊接位置不当也会留下“死角”而染菌。

图8-1 不锈钢衬里破裂造成“死角”

图8-2 发酵罐罐底脓疱状积垢

图8-3 罐底的加强板
管路的安装或管路的配置不合理易形成“死角”染菌。发酵过程中与发酵罐连接的管路很多，如空气、蒸汽、水、物料、排气、排污管等，一般来讲，管路的连接方式要有特殊的防止微生物污染的要求，对于接种、取样、补料和加油等管路一般要求配置单独的灭菌系统，能在发酵罐灭菌后或发酵过程中进行单独的灭菌。发酵工厂的管路配置的原则是使罐体和有关管路都可用蒸汽进行灭菌，即保证蒸汽能够达到所有需要灭菌的部位。在实际生产过程中，为了减少管材，经常将一些管路汇集到一条总的管路上，如将若干只发酵罐的排气管汇集在一条总的排气管上，在使用中会产生相互串通、相互干扰，一只罐染菌往往会影响其他罐，造成其他发酵罐的连锁染菌，不利于染菌的防治。采用单独的排气、排水和排污管可有效防止染菌的发生。生产上发酵过程的管路大多数是以法兰连接，但常会发生诸如垫圈大小不配套、安装未对中（见图8-4a、b）、法兰与管子的焊接不好、受热不均匀使法兰翘曲以及密封面不平（见图8-4c）等现象，从而形成“死角”而染菌。因此，法兰的加工、焊接和安装要符合灭菌的要求，务必使各衔接处管道畅通、光滑、密封性好，垫片的内径与法兰内径恰好相等，安装时对准中心，甚至尽可能减少或取消法兰连接等措施，以避免和减少管道出现“死角”而染菌。

图8-4 法兰的“死角”
a—垫圈内径过小；b—垫圈内径过大；c—法兰不平造成的泄漏与“死角”
种子罐底部的移种管须在发酵过程中或在培养基灭菌后才进行灭菌，如安装不当，就会存在蒸汽不易通达的“死角”(见图8-5a)，消除方法见图8-5b。压力表安装不合理会形成“死角”(见图8-6a)，消除方法是在近压力表处安装放汽边阀(见图8-6b)。

图8-5 灭菌时蒸汽不易通达的“死角”及其消除方法

图8-6 压力表安装不合理形成“死角”
1,6—发酵罐；2—缓冲管；3,4—压力表；5—旋塞
五、噬菌体污染及其防治
利用细菌或放线菌进行的发酵生产容易受噬菌体的污染，由于噬菌体的感染力非常强，传播蔓延迅速，且较难防治，对发酵生产有很大威胁。噬菌体是一种病毒，其直径约0.1 μm，可以通过环境污染、设备的渗漏或“死角”、空气系统、培养基灭菌过程、补料过程及操作过程等环节进入发酵系统。
由于发酵过程中噬菌体侵染的时间、程度不同以及噬菌体的“毒力”和菌株的敏感性不同，所表现的症状也不同。温和噬菌体（temperate phage）侵染菌体后由于具有溶源性，相对于烈性噬菌体（virulent phage）更加地隐蔽、危害更大。比如氨基酸的发酵过程，感染噬菌体后，常使发酵液的OD值在发酵初期不上升或回降；pH值逐渐上升，可到8.0以上，且不再下降或pH值稍有下降，停滞在pH7～7.2之间，氨的利用停止；糖耗、温升缓慢或停止；产生大量的泡沫，有时使发酵液呈现黏胶状；谷氨酸的产量很低、增长缓慢或停止；镜检时可发现菌体数量显著减少，甚至找不到完整的菌体；CO2排出量异常，产物含量急剧下降；培养时间和发酵周期延长；发酵液发红、发灰、泡沫很多、pH值难中和，提取分离困难，收率很低等。
噬菌体在自然界中分布很广，在土壤、腐烂的有机物和空气中均有存在，一般来说，造成噬菌体污染必须具备有噬菌体、活菌体、噬菌体与活菌体接触的机会和适宜的环境等条件。噬菌体是专一性的活菌寄生体，脱离寄主噬菌体不能自行生长繁殖，由于作为寄主的菌体的大量存在，并且噬菌体对于干燥有相当强的抗性，同时噬菌体有时也能脱离寄主在环境中长期存在。在实际生产中，常由于空气的传播，使噬菌体潜入发酵的各个环节，从而造成污染。因此，环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。
至今最有效的防治噬菌体染菌的方法是以净化环境为中心的综合防治法，主要有净化生产环境、消灭污染源、改进提高空气的净化度、保证纯种培养、做到种子本身不带噬菌体、轮换使用不同类型的菌种、使用抗噬菌体的菌种、改进发酵设备装置、消灭“死角”、药物防治等措施。
噬菌体的防治是一项系统工程，从培养基的制备、培养基灭菌、种子培养、空气净化系统、环境卫生、发酵设备、管道、车间布局及职工工作责任心等诸多方面，分段检查把关，才能做到根治噬菌体的危害。具体归纳以下几点：① 严禁活菌体排放，切断噬菌体的“根源”；② 做好环境卫生，消灭噬菌体与杂菌；③ 严防噬菌体与杂菌进入种子罐或发酵罐内；④ 抑制罐内噬菌体的生长。
生产中一旦污染噬菌体，可采取下列措施加以挽救：
⑴ 并罐法 利用噬菌体只能在处于生长繁殖的细胞中增殖的特点，当发现发酵罐初期污染噬菌体时，可采用并罐法。即将其他罐批发酵16～18 h（菌种处于稳定期）左右的发酵液，以等体积混合后分别发酵，利用其活力旺盛的种子，不进行加热灭菌，亦不需另行补种，便可正常发酵。但要肯定，并入罐的发酵液不能染杂菌，否则两罐都将染菌。
⑵ 轮换使用菌种或使用抗性菌株 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH值，立即培养要轮换的菌种或抗性种子，培养好后接入发酵罐，并补加1／3正常量的玉米浆(不调pH值)、磷盐和镁盐。如pH值仍偏高，不开搅拌，适当通风，至pH值正常、OD值增长后，再开搅拌正常发酵。
⑶ 放罐重消法 发现噬菌体后，放罐，调pH值(可用盐酸，不能用磷酸)，补加1／2正常量的玉米浆和1／3正常量的水解糖，适当降低温度重新灭菌，不补加尿素，接入2％的种子，继续发酵。
⑷ 罐内灭噬菌体法 发现噬菌体后，停止搅拌，小通风，降低pH值，间接加热到70～80 ℃，并自顶盖计量器管道(或接种管、加油管)内通入蒸汽，自排气口排出。因噬菌体不耐热，加热可杀死发酵液内的噬菌体，通蒸汽杀死发酵罐及管道内的噬菌体。冷却后，如pH值过高，停止搅拌，小通风，降低pH值，接入2倍量的原菌种，至pH值正常后开始搅拌。
当噬菌体污染情况严重，上述方法无法解决时，应调换菌种，或停产全面消毒，待空间和环境噬菌体密度下降后，再恢复生产。
六、杂菌污染的挽救与处理
发酵过程一旦发生染菌，应根据污染微生物的种类、染菌的时间或杂菌的危害程度等进行挽救或处理，同时对有关设备也进行相应的处理。
⑴ 种子培养期染菌的处理 一旦发现种子受到杂菌的污染，该种子不能再接入发酵罐中进行发酵，应经灭菌后弃之，并对种子罐、管道等进行仔细检查和彻底灭菌。同时采用备用种子，选择生长正常无染菌的种子接入发酵罐，继续进行发酵生产。如无备用种子，则可选择一个适当菌龄的发酵罐内的发酵液作为种子，进行“倒种” 处理，接入新鲜的培养基中进行发酵，从而保证发酵生产的正常进行。
⑵ 发酵前期染菌的处理 当发酵前期发生染菌后，如培养基中的碳、氮源含量还比较高时，终止发酵，将培养基加热至规定温度，重新进行灭菌处理后，再接入种子进行发酵；如果此时染菌已造成较大的危害，培养基中的碳、氮源的消耗量已比较多，则可放掉部分料液，补充新鲜的培养基，重新进行灭菌处理后，再接种进行发酵。也可采取降温培养、调节pH值、调整补料量、补加培养基等措施进行处理。
⑶ 发酵中、后期染菌处理 发酵中、后期染菌或发酵前期轻微染菌而发现较晚时，可以加入适当的杀菌剂或抗生素以及正常的发酵液，以抑制杂菌的生长速度，也可采取降低培养温度、降低通风量、停止搅拌、少量补糖等其他措施，进行处理。当然如果发酵过程的产物代谢已达一定水平，此时产物的含量若达一定值，只要明确是染菌也可放罐。对于没有提取价值的发酵液，废弃前应加热至120 ℃以上、保持30 min后才能排放。
⑷ 染菌后对设备的处理 染菌后的发酵罐在重新使用前，必须在放罐后进行彻底清洗，空罐加热至120 ℃以上、30 min灭菌后，才能使用。也可用甲醛熏蒸或甲醛溶液浸泡12 h以上等方法进行处理。
思考题
⒈ 简述发酵异常的原因，工业生产上检查发酵系统是否污染杂菌有哪些方法。
⒉ 简述发酵生产过程中杂菌污染的途径及防治方法。

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